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淋巴细胞主动免疫治疗92例反复自然流产患者的疗效分析

来源:本站原创 日期:2013-12-18

淋巴细胞主动免疫治疗92例反复自然流产患者的疗效分析

汪丽,赵立芬*,翁宁,许蓬,李芃,颜红,徐鑫

沈阳东方医疗集团菁华医院,沈阳110005

 

【关键词】反复自然流产;封闭抗体;免疫治疗;淋巴细胞接种

临床上自然流产连续发生3次或以上者,称为反复自然流产(recurrent spontaneous abortionRSA),是妇科常见的并发症,其发生率占总妊娠数的0.4%1.0%,如按连续发生2次计算则为5%[1]。近年来的研究表明,除常见的遗传因、内分泌紊乱、子宫解剖结构异常、感染因素外,40%80%RSA患者与免疫因素有关,还包括部分男性因素[2,3]。免疫因素除一部分与自身抗体有关外,另一部分原因被认为是母胎双方免疫不适应,其中封闭抗体缺乏是主要因素[4]。采用淋巴细胞主动免疫疗法,可刺激封闭抗体的产生,阻止胚胎遭受母体免疫攻击而发生流产[5]。我们对20123月~20131月在沈阳东方医疗集团菁华医院就诊的510RSA患者进行封闭抗体水平测定,并对其中92例封闭抗体阴性的RSA患者进行免疫治疗,观察其疗效。

 

.资料与方法

1.研究对象:观察20123月~20131月在沈阳东方医疗集团菁华医院就诊的510例反复自然流产的患者,并对其中92例患者进行免疫治疗,并观察治疗效果。年龄 23-45岁,流产次数≥3次。排除遗传因素,内分泌紊乱,子宫解剖结构异常,感染因素,进行封闭抗体的检测及淋巴细胞主动免疫治疗。

2.研究方法: (1)标本的采集:抽取RSA患者静脉血3ml,将离心后分离出的血清置于1mleppendorf管中,-20保存,封闭抗体的检测采用酶联免疫吸附法(ELESA)(Gen-probe GTI Diagnostics Inc USA 由北京博富瑞基因诊断技术有限公司提供)。(2) 主动免疫治疗方法:对92RSA患者的丈夫均检测血清以排除肝炎病毒、艾滋病病毒、梅毒螺旋体等感染,其中一项指标异常,即为不合格。继而重新筛选健康第三者作为血源提供者(健康第三者要患者本人选择),所有患者均为自愿接受治疗。无菌条件下抽取丈夫或健康第三者空腹静脉血20ml0.8ml肝素抗凝),10ml淋巴细胞分离液(由中国上海恒信化学试剂有限公司生产,沈阳博尔美试剂有限公司提供)分装在315ml无菌的淋巴细胞分离管中,再将 20ml静脉血缓慢加到分离液上层。第1次离心,2500r/min离心30min,离心后液体由上至下分四层。用无菌吸管吸出第二层细胞(淋巴细胞分离层),置入另一支无菌分离管中,加入0.9%氯化钠注射液至10ml,混匀。离心3次,均为2500r/min 10min,离心后弃上清,加入0.9%氯化钠注射液至10ml,混匀,最后一次离心后弃上清,加入0.9%氯化钠注射液0.7ml0.9ml,使其浓度达到(2040)×106淋巴细胞/ml

用制成的淋巴细胞悬液,立即对92例患者前臂外侧皮内注射,一般为57个点,30min后观察局部反应,如果局部出现红肿水泡,血肿等反应,应予冰敷,抗过敏,预防感染等处理。每34周治疗一次,35次为1个疗程,1个疗程后复查封闭抗体水平。封闭抗体转阳者可尽快妊娠,妊娠后继续进行34次主动免疫治疗[6];对复查封闭抗体依旧为阴性者,继续进行第23个疗程的治疗。

3. 统计学方法:应用SPSS10.0统计学软件,率的比较用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

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1.免疫治疗前后封闭抗体阳性率的比较:510例患者中有92APLP水平阴性者进行免疫治疗,1个疗程后APLP阳性率为46.7%43/92),2个疗程后APLP总阳性率为88.0%81/92),剩下的11例患者继续进行第3个疗程的治疗。与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.免疫治疗前后封闭抗体水平的变化:经观察发现92RSA患者,封闭抗体的水平有上升式趋势,比率为95.6%88/92)。另有4例患者免疫治疗两个疗程后依旧无明显差异。

3.免疫治疗后妊娠结局:在接受治疗的92RSA患者中有74例妊娠成功,但尚未至分娩期。据了解和随访到的妊娠周期结局,分别为≥2523例,212518例,172120例,121713例,而再次妊娠失败者一般都在12周以内发生,因此免疫治疗后妊娠成功率为80.4%74/92)。

4.免疫治疗后封闭抗体阳性者和阴性者的妊娠结果:92RSA患者接受第1个疗程主动免疫治疗后,转阳性者43人,再次妊娠成功者32例,第2个疗程主动免疫治疗后,转阳性者38人,再次妊娠成功者36例,总计68例,其比率为84.0%(68/81);另外11例封闭抗体仍为阴性者中有6例经主动免疫治疗1-2个疗程后意外再次妊娠,其比率为54.5%6/11)。经免疫治疗后,APLP转阳性者再次妊娠成功率明显高于APLP阴性者,两者比较差异具有显著性,(P<0.05)见表4

4 免疫治疗后封闭抗体阳性者与阴性者的妊娠结局比较

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->封闭抗体类型  例数(n) 妊娠成功   再次流产  妊娠成功率(%

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->   抗体阳性      81        68          13          84.0

   抗体阴性      11        6           5           54.5

    合 计        92        74          18          80.4

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->注:两组比较,χ2=5.32P<0.05

5.免疫治疗后不良反应的观察:经免疫治疗的RSA患者,未出现过敏反应,荨麻疹及传染病等。

 

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1.淋巴细胞免疫治疗的机制:正常妊娠夫妇的人类白细胞抗原不相容,胚胎来自父方的人类白细胞抗原能刺激母体免疫系统并产生抗配偶淋巴细胞的特异性IgG抗体(即封闭抗体)。而反复自然流产夫妻之间的人类白细胞抗原位点共容性大,从而导致母体免疫系统对胚胎抗原无法识别,未能产生封闭抗体,将来自父方的一半被当作异物排斥而导致流产。

人类白细胞抗原基因位于六号染色体短臂上,由I类(MHC-ABC位点编码)和II类(MHC-D)抗原组成,I类几乎全部分布于身体细胞表面,主要作用是参与免疫识别;II类定位于巨噬细胞和淋巴细胞表面的糖蛋白,主要作用是通过细胞与细胞间的相互作用调节免疫反应。T淋巴细胞抗原受体(TCR),是T淋巴细胞特有的表面标志,可表达于所有成熟T淋巴细胞表面。T淋巴细胞识别抗原和转导信号是由TCR特异识别MHC分子提呈的抗原肽,CD3分子转导T细胞活化的第一信号,TCRCD3分子通过盐桥结合形成稳定的复合物,TCR识别抗原的这一特点构成了MHC限制性的基础。TCR有α、β、γ、δ四种肽链,根据TCR异二聚体的不同组成,可将其分为TCRαβ和TCRγδ两种类型。TCRγδ在外周血中极少,却构成机体的一道重要免疫监视防线。TCRγδ分为Vγ9Vδ2T淋巴细胞和Vγ9Vδ1T淋巴细胞,RSA患者体内以Vγ9Vδ2T淋巴细胞为主,这类细胞合成TH1型细胞因子;正常妊娠孕妇体内以Vγ9Vδ1T淋巴细胞为主,这类细胞合成TH2型细胞因子。因此,赵静等报道称[7],淋巴细胞主动免疫治疗可下调TH1型细胞因子、上调TH2型细胞因子,促使TH1型细胞因子向TH2型细胞因子转换,促使妊娠早期母体处于免疫耐受状态,有利于妊娠成功。也有研究证明[8],经主动免疫治疗后,TCRγδT细胞水平及TCRγδT淋巴细胞/CD3T淋巴细胞比值显著增加。

淋巴细胞免疫治疗主要就是利用父方或健康第三方的免疫细胞注入到母体内,从而刺激母体免疫系统,诱导体内产生抗人类白细胞抗原以及促使TH1型细胞因子向TH2型细胞因子转换,来阻止胚胎父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤,使胚胎得到保护并生长发育,反复刺激母体免疫系统,又可提高其机体的免疫记忆,有利于下次妊娠的成功[9]

2.淋巴细胞治疗总量和治疗方法直接影响免疫治疗效果:通过对本院510RSA患者的检测,发现RSA患者封闭抗体阳性率较低,当通过淋巴细胞主动免疫治疗后,极大地提高了RSA患者体内封闭抗体水平,同时随着免疫治疗次数的增加抗体的滴度水平也有明显的升高趋势,这与付锦华等的研究结果一致[10]。而抗体滴度水平无明显变化的患者,一方面与个人机体的免疫耐受有关;另一方面与治疗的淋巴细胞总量和治疗方法有关。

据资料调查和不完全统计,单次免疫治疗的淋巴细胞总数在4×107以上为宜,按人体血液淋巴细胞含量(830)×105/ml计算,则采用丈夫或健康第三者静脉血的量至少为20ml,30ml以上较好。当前国内淋巴治疗总量大部分较低,分析主要原因有两方面:一是国内采用丈夫或健康第三者静脉血的量较少导致淋巴细胞提取量不足。目前国内一般采用2030ml的较为多见,个别有4050 ml的报道,预计未来4050ml采血量将是行业所趋。二是淋巴细胞分离液的选择直接影响细胞的提取率。据路宝霞[6]的最新报道称,选用进口高质量的淋巴细胞分离试剂,可分离出较多的淋巴细胞悬液,治疗效果明显,转阳率较高,并且未对患者产生不良影响。

另有报道[11],国外一般采用高浓度小剂量的细胞悬液对患者进行免疫治疗,浓度可达120×106/ ml,治疗悬液量较小,治疗周期短,效果好,患者治疗痛苦程度低。而国内分离出的细胞悬液浓度为(20-40)×106/ ml的较多,悬液量12ml左右,治疗效果差异较大[4]。因此,在保证单次淋巴治疗总量大于4×107以上的前提下,采用高浓度小剂量的细胞悬液,既有好的效果,又能减轻患者治疗时所带来的痛苦,以及经济负担和心理负担。

3. RSA患者封闭抗体转阳性前不宜接受妊娠:在研究中发现,11例封闭抗体仍为阴性者中有6例经主动免疫治疗12个疗程后意外再次妊娠,这很可能是因为经过主动免疫治疗后,刺激了患者体内的免疫系统,从而增强了封闭效应所致,但APLP阴性者妊娠成功率明显低于阳性者,这说明经主动免疫后封闭抗体未转为阳性的RSA患者,再次妊娠,仍有一定的流产风险,因此在临床上我们建议RSA患者直至APLP转阳性后再接受妊娠。

综上所述,我院采用淋巴细胞主动免疫治疗的方法来降低反复自然流产的发生,已经取得一定的效果,92RSA患者经过12个疗程免疫治疗后有74人再次妊娠成功(妊娠周期≥12周),封闭抗体转阳性者妊娠率可达84.0%(68/81)。因此,淋巴细胞主动免疫治疗的这种技术简单,成功率高,无明显不良反应的治疗方法,在治疗反复自然流产患者中应得到广泛应用。

【参 考 文 献】

[1]许红,雷灵梅.反复流产与封闭抗体缺乏的关联研究[J].河北医药,201133:690-691.

[2]Collins JA,Crosignan iPG.Unexplained infertility:a rewiew of diagnosis prognosis treatment efficacy and management[J].Int J Gynecol Obest199239:267-268.

[3] 李宏军. 复发性流产的男性因素及治疗[J]. 中国实用妇科与产科杂志. 2013,29118-122.

[4]黄会霞.复发性流产的淋巴细胞主动免疫治疗效果观察[J].医药论坛杂志. 200933:3-4.

[5] 杨宁,秦卫兵,王一峰,等. 复发性流产患者淋巴细胞主动免疫治疗效果观察[J]. 中国计划生育学杂志,20132151-53.

[6]路宝霞. 淋巴细胞免疫治疗在复发性流产中的应用[J].中国医药指南,201210:117-118.

[7]赵静,巩晓芸,胡泊等. 淋巴细胞主动免疫治疗不明原因复发性流产91例临床研究[J].新疆医科大学学报,201134:77-78.

[8]孙曙光,王秀霞. 反复流产患者15例主动免疫治疗后TCRγδT淋巴细胞水平的变化[J].中国实用妇科与产科杂志,200521:229-230.

[9]彭婀娜,姚若进.不明原因复发性流产主动免疫治疗前后封闭抗体的变化及其意义[J].实用妇产科杂志,201026:773-775.

[10]付锦华,肖素芳.反复妊娠丢失的淋巴细胞免疫治疗[J].职业与健康,2002,18:139-140.

 [11]周毅,周敏,丘彦.反复性自然流产与淋巴细胞主动免疫治疗进展.实用妇产科杂志.2003.19:84-85

 

 


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